食品微生物菌落总数测定注意事(shì)项

菌落总数主要是作为判定食品被(bèi)细工時菌污染程度的标记，也可以应用這(zhè)一朋跳方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态，以便對(duì)被(bè好劇i)检樣(yàng)品進(jìn)行卫生學(xué)评价時(shí)提術舊供科學(xué)依据。

一、菌落总数测定的几项說(shuō)明

1．菌落总数的测定：

是以检樣(yàng)中的细菌细胞和营养琼脂培养離湖基或者平板计数琼脂或胰酪大豆胨琼脂培养基（你市根据检验标准要求选择相应的培养基）混合後(hòu知議)，每个细菌细胞都(dōu)能(néng)形成(c山資héng)一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有房那氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能(néng)测出每g或mL检黑兵樣(yàng)中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不為來生長(cháng)，有特殊营养要求的一些细菌也受到(文厭dào)了限制，因此所得结果，只包括一群能吃身(néng)在普通营养琼脂培养基中發(fā)育、嗜中温的、需氧和窗姐兼性厌氧的细菌菌落的总数。

2．鉴于检樣(yàng)中的细菌细胞是以单个，成(chéng)双、链状、葡萄状書刀或成(chéng)堆的形式存在，因而在菌落总数测定培術區养基平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所站來得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面(很物miàn)积内的菌落数或菌落形成(chéng)单位数(colony fo知微rming units，CFU)报告從醫之。

3．每種(zhǒng)细菌都(dōu)有它一定的生理特性，培見通养時(shí)，应用不同的营养条件及其他生理条計到件(如温度、培养時(shí)间、pH、需氧性麗作质等)去满足其要求，才能(néng)分别將(jiāng)報間各種(zhǒng)细菌都(dōu)培內術养出来。因此，要得到(dào)较全面(miàn)技得的细菌菌落总数，应將(jiāng)检樣(yàng厭內)接種(zhǒng)到(dào)几種(zhǒng)不同的非选择性培养基上到謝，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。

二、菌落总数的测定

测定食品中菌落总数時(shí)，是將(j森又iāng)食品检樣(yàng)做成(chéng)几个不同的10倍递增稀释液，然個農後(hòu)从各个稀释液中分别取出一定量在平皿内与菌落总数資志测定培养基相混合，經(jīng)培养後(hòu)湖坐，按一定要求计算出皿内琼脂平板上所生成(亮子chéng)的细菌集落数，并再根据检樣(yàng)的稀释倍数，计算出每g動媽或mL樣(yàng)品中所含细菌菌落的总数。

三、菌落总数测定中的一些要求和规定

为了正确地反映食品中各種(zhǒng)需氧和兼性厌氧菌存在的還們情况，检验時(shí)必须遵循以下一些要求和规定：

(一)所用器皿及稀释液：

1. 检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、路白试管等必须是*灭菌的，并在灭菌前*洗涤干净，不得残和公留有抑菌物质。

2. 用作樣(yàng)品稀释的液体，每批都(dōu)要有空白對(duì)照費件。如果在琼脂對(duì)照平板上出现几个菌落時(shí)，要追加對(duì)年資照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，還(hái)是平們又皿吸管或空气可能(néng)存在的器場污染。

3. 检樣(yàng)的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水，但以用磷見費酸缓冲盐水特别是0.1％蛋白胨水为合科子适，因蛋白胨水對(duì)细菌细胞有更好(hǎ亮我o)的保护作用，不會(huì)因为在稀释過能的(guò)程中而使食品检樣(yàng)中原已受损伤的森門细菌细胞导致死亡。如果對(duì)含盐量较高的食品(如，酱品等)進(jìn樂老)行稀释，则宣采用蒸馏水。

(二)检樣(yàng)稀释：

1. 检樣(yàng)稀释時(shí)，应以无菌手续称取(或雜日量取)有代表性的樣(yàng)品25g(或mL)剪碎放于含有225ml灭菌又山稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，經(jīng)充分振摇作高有成(chéng)l：10的稀释液民睡。如系肉、鱼等固体樣(yàng)品，尽量剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中（國(guó)老和产均质器，目前以江苏武進(jìn)郑陆医學(xué)仪器厂产品较简便而实費紅用），以8000～10000rpm速度搅拌1分钟，慢技使做成(chéng)均匀的1：10稀释液。

2. 根据食品卫生标准要求或對(duì紙自)标本污染情况的估计，將(jiāng)上述1:10的检樣(y習可àng)稀释液再做成(chéng)几个适当的10倍递增木議稀释液。即取1：10稀释液1mL与9mL稀释液知老混和做成(chéng)l：100的稀释液，村鐘然後(hòu)依次递增稀释，做成(ché些輛ng)1：1000、1：10000等稀释液。注意每递信海增稀释一次，必须另换1支l mL灭菌他內吸管，這(zhè)樣(yàng)所得检樣(yàng)的船學稀释倍数方为准确。

3. 从吸管筒内取出灭菌吸管時(shí)，不要將(jiāng)吸管碰冷校著(zhe)其他仍留在容器内的吸管森東的外露部分；而且吸管在進(jìn)出装有稀释液的玻璃瓶和试管時(這身shí)，也不要触及瓶口及试管口的外侧部裡那分；因为這(zhè)些部分都(dōu)可能(néng)接作校触過(guò)手或其他沾污物。

4. 在作10倍递增稀释中，吸管插入检樣(yàng)稀释液内不能(néng)司水低于液砸2.5cm；吸入液体時(shí)，应先高于吸管刻度，然後(hò放了u)提起(qǐ)吸管离開(kāi)液面(miàn)，將(店在jiāng)贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调至所高著要求的刻度，這(zhè)樣(yàng)取樣(yàng)较准确，而且嗎業在吸管从稀释液内取出時(shí)不會(huì票購)有多余的液体粘附于管外。 

5. 当用吸管將(jiāng)检樣(yàng)稀释液加至業廠另一装有9mL空白稀释液的试管内時(s日下hí)，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管外侧部分粘附的检液也混入讀爸其中。

(三)平板接種(zhǒng)与培养：

1. 將(jiāng)稀释液加至灭菌平皿内時(shí)，应根喝場据食品卫生标准要求或對(duì)綠學标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍是從递增稀释的同時(shí)，即以吸取该稀紙數释度的吸管移lmL稀释液加入皿刀照内(从皿侧加入，不要揭去皿盖)，後(hòu)將(jiāng)吸說短管直立使液体流毕，并在皿底干燥处通知再擦一下吸管尖將(jiāng)余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2跳近个平皿。

2. 用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使融化，并保温于45±1℃音從恒温水浴中待用。倾注平皿時(shí)，每皿内倾入约15mL，讀和後(hòu)將(jiāng)琼脂底部带有沉淀的部分弃去。地用

3. 为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿後(hòu)，应在20著又分钟内向(xiàng)皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。爸筆

4. 检樣(yàng)与琼脂混和時(shí)，可將(jiāng)雨動皿底在平面(miàn)上先向(xiàng)一个方向(xi木費àng)旋转，然後(hòu)再向(xiàng)相反的方向(xiàng)旋转，體書以使充分混匀。旋转中应加小心，不要使混和物溅到(dào)皿街坐边的上方。为了保证混和均匀，而不溅及皿边的上方，可使用江苏省无锡县卫生防疫站黃答童鹤泉设计制成(chéng)的自动平皿旋转仪，直接將(jiāng)加有拍他检樣(yàng)的平皿放在旋转仪上(可同時(shí)放4只平皿)，加入琼脂後(裡紙hòu)，開(kāi)动电钮，在数十秒钟内即可自动左右旋转而使好在皿内的检樣(yàng)与琼脂混合均匀。

5. 皿内琼脂凝固後(hòu)，不要長(cháng)久朋但放置，然後(hòu)始翻转培养作綠，而应于琼脂凝固後(hòu)，在数分钟内即应將(jiāng)平動遠皿翻转予以培养，這(zhè)樣(yàng)可避免菌落蔓延生廠吃長(cháng)。必要時(shí)，可先將(jiāng)皿打開(kā業聽i)倒置(皿底向(xiàng)兒離上)于温箱内經(jīng)15些河~60分钟使琼脂表面(miàn)干燥後(hòu)，再將(ji新相āng)皿底移至盖内倒置于温箱内來高培养。這(zhè)樣(yàng)可以阻止运动性强的变形杆菌属、假去窗单胞菌属和芽胞杆菌属中一些菌株視購在琼脂表面(miàn)扩展生長(做時cháng)。

6. 为了控制污染，在取樣(yàng)進(j樹鐘ìn)行检验的同時(shí)，于工作台上打開(kāi)一块琼脂平板，其暴露的時厭對(shí)间，应与该检樣(yàng廠刀)从制备、稀释到(dào)加入平皿時(shí)所暴露的長(chá雪會ng)的時(shí)间相当，然後(hòu)与加有检樣(y現雨àng)的平皿一并置于温箱内培养，以了解检樣(yàng)在检验操作道花過(guò)程中有l无受到(dào)来自空气的污染。

7. 培养温度：

应根据食品種(zhǒng)类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，兵日水产品用30℃培养。培养時(shí)间为48±2小時報錢(shí)。其他食品，如，清凉饮料，调理快味品，糖果、糕点．果脯，酒类(主要为發黃業(fā)酵酒)、豆制品和酱腌莱均系用37℃24±2小時(shí作綠)培养。培养温度和時(shí)间之所以有這暗些(zhè)種(zhǒng)不同的区分，乃是因为在制定這(z工章hè)些食品卫生标准中关于菌落总数的规定時要村(shí)，分别采用了不同的温度和培养時(shí)间所取得的白地数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细從劇菌方面(miàn)的卫生标准時(shí)，系用30℃作为培养的温度。

(四)對(duì)照试验：    &nb雨數sp; 

1. 加入平皿内的检樣(yàng)稀释液(特别是10：1的稀释液)，有肘带有聽子食品颗粒，在這(zhè)種(zhǒng)情况下，为了避免与细菌菌落間綠發(fā)生混淆，可作一检樣(yàng)稀释液和白与琼脂混和的平皿，不經(jīn公妹g)培养，而于4℃环境巾放置，以便在计数捡樣(yàng)菌落時懂很(shí)用作對(duì)照。

2. 为了防止检樣(yàng)中食品有小颗粒与菌落混淆，也可在已溶化而保温于45℃水浴内的琼飛男脂中，按每100ml加lmL，0.暗路5％氯化三苯四氮唑(2，3，5triphenylte金報trazolium chloride，TT是資C)水溶液之量加入适量的TTC。培养後(hòu)，如是食品颗粒，不见变家西化，如为细菌，则生成(chéng)红色菌落，化學配好(hǎo)的TTC溶液，应先用来与不加TTC的作對(duì)照，以观有門察其對(duì)计数是否有不利的作用(TTC在一定浓度下對(duì)革兰氏日吃阳性菌有抑制作用)。TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照鄉市而發(fā)生分解。无色的TT長但C是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌下作存在，培养後(hòu)，在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成(chén的木g)为红色的三苯基甲艏(formazan)，使菌落呈雪鐘现红色。

(五)菌落计数：

1. 从温箱内取出平皿進(jìn)行菌落计数時(shí)，应先分别观察同一生年稀释度的兩(liǎng)个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上暗場菌落生長(cháng)情况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释票嗎度的几个平板上菌落数则应与检樣美外(yàng)稀释倍数成(chéng)反比，即检樣(yàng)稀释倍数越大，菌落家路数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。

2. 计数菌落時(shí)，应选取菌落数在30~300之明歌间的平板作为菌落总数测定的标准。1个稀熱冷释度使用兩(liǎng)个平板，員議应采用兩(liǎng)个平板平窗服均数；如其中一个平板有较大片状菌落生長(cháng)時(shí)，低綠则不宜采用，而应以无片状菌落生長(c計得háng)的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到(dào妹唱)平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可文即可计算半个平板後(hòu)乘2以代表全皿菌落数。如在藍妹一个稀释度的兩(liǎng)个平板中，一个平板的菌落数在30～300之间，街唱另一个大于300或小于30時(下數shí)，则以菌落数在30～300得街间的平板作为计数的标准。

3. 注意事(shì)项

(1)如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验司體工作中發(fā)生的差错，属实验室事(shì)故明報。此外，也可能(néng)因抑知化菌剂混入樣(yàng)品中所致，均不可用作检樣(yàng)计数能商报告的依据。

(2)如果平板上出现链状菌落，菌落知子之间沒(méi)有明显的界限，這(zhè)是在琼脂与文到检樣(yàng)混合時(shí)，一个细菌块被(bèi)技飛分散所造成(chéng)。一条链笑器作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，坐話每条链作为一个菌落计，不要把链上生長(cháng)的舊吧各个菌落分開(kāi)来数。此外，如皿内琼脂凝固後(hòu)未及時(shí刀話)進(jìn)行培养而遭受昆虫侵算西入，在昆虫爬過(guò)的地方也會(huì)出现链状菌落，哥舊也不应分開(kāi)来数。

(3)如果所有平板上都(dōu)有菌落密布，不要用多地店不可计作报告，而应在稀释度大的平板上，任意数其中2玩市cm2个，除2求出每cm2内平均菌落数乘以皿底面(miàn)积63.6cm行他2数，再乘其稀释倍数作报告。例如10-1～10-3稀释度的所劇光有平板上均菌落密布，而在lO-3稀释的平板上任数2个cm2。内的她爸菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检樣有吃(yàng)每g(或m1)中“估计”菌落数为：北睡60／2×63．6×1000=19在技08000或1.9×106。

63.6cm2数系按皿底直径为9cm時(shí)计算而地中得，即：(9／2)2×3．14=63．6；如所用平皿的哥道皿底直径不是9cm，则可按其直径的实际cm数代人圆面為她(miàn)积公式求出。

(4)菌落计数中，如能(néng)使用國(guó)产JLQ-S。型菌落计数器笑公，则比较方便，灯光由侧面(miàn)射房有向(xiàng)平板，菌落易于观察。由于仪器带有电子音响訊坐讯号，用特制金属探笔点数中，在發(fā)出音响音些之下始显示数字增加，不會(huì)發(fā)生差遠知错。且灯光与平板之间夹有多用方格玻质舊你规板(方格面(miàn)积为lcm2)，也有助于對(duì)菌大地落密布的平板進(jìn)行计数。

(5)检樣(yàng)如系微生物类制剂多公(如酸牛乳、酵母制酸性饮料)，则平板计数中应相应地將電器(jiāng)有关微生物(乳酸杆菌、酵母菌)排除，不可河雪并入检樣(yàng)的菌落总数内作报告。一般在校正检樣日遠(yàng)的pH7．6後(hò章數u)，再進(jìn)行稀释和培养，此类嗜酸性微生物往往即不易生長(c拿電háng)。并可用革兰氏法染色鉴别。染色鉴别時(shí)，要用不校正去章pH的检樣(yàng)做成(chéng)相同稀農她释度的稀释液培养所生成(chéng)的菌落涂片染色作對唱計(duì)照，以资辨别。酵母菌卵圆形，远比细菌大，大小为2～5問愛×5～30μm，革兰氏阳性著(zhe)色。乳酸山樹杆菌在24小時(shí)内，于普通营作車养琼脂平板上在有氧条件下培养，通常是不生長(ch是舞áng)的。

(六)报告方式

1. 菌落数小于100CFU 時(shí)校科,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。菌落数大于或等于100CFU 他鐘時(shí),第3位数字采用“四舍五入”原则修约後(hòu),取前2位数字,後哥弟(hòu)面(miàn)用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入高影”原则修约後(hòu),采用兩(liǎng)位有效数和店字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落內爸蔓延。若空白對(duì)照上有菌落生長(cháng),则此次检测结果无效。

2. 检樣(yàng)为固体，用重量法取樣(yàng)检验時(sh讀南í)，以g为单位报告其菌落数；检樣(y答自àng)为液体，用容量法取樣(yàng)检验時(shí)，以mL为吃這单位报告其菌落数；如检樣(yàng)为樣(yàn生厭g)品表面(miàn)的涂擦液，则应以cm2为单位报告其菌落火購数。

3. 如检樣(yàng)为液体，在兩讀門(liǎng)个平皿内所加lmL未經(錯話jīng)稀释的检樣(yàng)(原液)培养中，均无细菌集落生成(ché少鐘ng)，则报告为lmL检樣(yàng)内未有菌落生長(cháng)，通低或1mL检樣(yàng)内菌落数<1。

四、特殊的方法

(一)平板表面(miàn)涂布法

將(jiāng)营养琼脂制成(chéng)平板，經(jīng)50℃，l－2市說小時(shí)或35℃，18－20小時(shí風個)干燥後(hòu)，于其上滴加話關检樣(yàng)稀释液0.2mL，用L捧涂布于整个平板的雨窗表面(miàn)，放置片刻(约10分钟)，將(ji木飛āng)平板翻转，移至36&plusm區機n;1℃温箱内培养24±2小時(shí)(水产品用30℃培养4河慢8±2小時(shí))，取出，按前述方式進(jìn)行菌落计数費坐，然後(hòu)乘以5(由0.2兵又mL换算为1mL)，再乘以樣(yàn用黑g)品稀释的倍数，即得每g或mL检樣(yàng)所含菌落数。

此法较上述倾注法为优，因菌落生長(cháng)在表面(m答放iàn)，便于识别和检查其形态，虽检樣(yàng)中哥他带有食品颗粒也不會(huì)發(fā)生混淆，筆自同時(shí)還(hái)可使细菌一還不必遭受融化琼脂的热力，不致因此而使菌细胞受到(dào)损伤放公而不生長(cháng)，从而可避免由于检验操作中的不地現良因素而使检樣(yàng)中细菌菌落数降低。但是本法取樣(y懂謝àng)量较倾注法为少(仅倾注法的五分之一)，代表性人中將(jiāng)受到(dào)一定的影响。

(二)平板表面(miàn)点滴法

与涂布法相似，所不同者，只是用标定好(hǎo討對)的微量吸管或注射器针头按滴（使每滴相当于0.025mi）將(j刀老iāng)检樣(yàng)稀释間綠液滴加于琼脂平板上固定的区域（了著预先在平板背面(miàn)用标店在记笔划成(chéng)四个区域），每个区域滴1滴，每个稀释度滴兩(從近liǎng)个区域，作为平行试验。滴加後(hòu笑笑)，將(jiāng)平板放平片刻（约5玩那～10分钟），然後(hòu)翻转平板，如村南前移入温箱内培养6～8小時(shí)後(hòu)進(jìn)行计数，將(會又jiāng)所得菌落数乘以40（由0.025mL换算为歌內1mL），再乘以樣(yàng)品稀释的倍数暗紙，即得每g或mL检樣(yàng)所含數笑菌落数。