细菌的简单染色和革兰氏染色及其注意事(shì)项

革兰氏染色法

（一）原理：

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带子鐵正电荷，能(néng)和带负电荷的物质结合。因细菌蛋讀山白质等电点较低，当它生長(cháng)于中性、碱性或弱酸性的溶液中時(s快道hí)常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使市店其著(zhe)色。酸性染料的离子带负电荷，能(néng)与带正电荷的物质结合。術林当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降時(南工shí)，细菌所带正电荷增加，因此易被(bèi)伊红、酸性复红或煙錯刚果红等酸性染料著(zhe)色。中性染行答料是前兩(liǎng)者的结合物又称复合染料，如伊筆吧红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一種(zhǒn的煙g)染料使细菌著(zhe)色以显示其形态，简单染色不能(néng)辨别细章道菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理學(xué)家C.G音請ram所创立的。革兰氏染色法可將(jiāng)所有的细菌区分为革了的兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）兩(liǎng)大类，是细菌學(x兵多ué)上zui常用的鉴别染色法。该染色法所以能(néng)將(jiāng)细菌兵煙分为G+菌和G—菌，是由這(zhè)兩(liǎng)类菌的细胞壁结构和成(c影間héng)分的不同所决定的。G—菌的细胞說事壁中含有较多易被(bèi)乙醇溶解的类脂质，而且肽聚相關糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色時(shí)溶解了类脂质，增加了细身這胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就(jiù)被日路(bèi)脱色，再經(jīng)蕃红复染後(hòu)就(j自短iù)成(chéng)红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且高雨交联度高，类脂质含量少，經(jīng)脱色剂处理後(h照制òu)反而使肽聚糖层的孔径缩小，遠又通透性降低，因此细菌仍保留初染時(shí)中習的颜色。

（二）器材

1、菌株：培养12-16h的苏小書云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯短民草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小時(計在shí)的大肠杆菌（Escherichia coli）

2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲師飛苯、香柏油

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接種(zhǒn跳廠g)杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜

（三）革兰氏染色方法：

1、以酒精擦拭玻片，在酒精灯上干燥後(照女hòu)，用接種(zhǒng)环舊雪挑取一环灭菌的去离子水或生理盐水到(dà問謝o)载玻片上，挑取少量纯培养物在水滴上綠明涂抺至均匀分散，將(jiāng)涂片在酒精灯火焰上灭科照活、固定。

2、滴加结晶紫染色液1-2 滴，染1 分钟，用我市去离子水轻轻水洗。

3、待干，滴加革兰氏碘液，作用1 分钟，用去离子水轻轻水洗。

4、滴洗脱色剂（95%酒精），不時(s人熱hí)摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约10～20 鐵火秒），用去离子水轻轻水洗。

5、待干，滴加沙黄复染液，复染30 秒。用去离子轻轻水洗，待玻片干燥後(hò車和u)镜检。

6、油镜镜检。菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌；呈红日外色者为革兰氏阴性菌。

（四）注意事(shì)项 

1.革兰氏染色成(chéng)败的关畫男键是酒精脱色。如脱色過(guò)度，革兰氏阳性菌也可被(bè文區i)脱色而染成(chéng)阴性菌；如脱色時(shí)慢一间過(guò)短，革兰氏阴性菌也會(huì)海還被(bèi)染成(chéng)革兰氏阳性菌。脱色時(shí)间的長(c吧志háng)短還(hái)受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影爸妹响，难以严格规定。 

2.染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水冲洗後(hòu)，制就应吸去玻片上的残水，以免染色液被(bèi)稀释內草而影响染色效果。 

3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16錢土h，E.coli培养24h。若菌龄太這是老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴個校性反应。

细菌芽孢染色法

（一）原理

细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著(zhe)色，若用一般染光刀色法只能(néng)使菌体著(zhe)色而芽胞不著(zhe)色（芽胞呈无色聽作透明状）。芽胞染色法就(jiù)是根据芽胞既难以染色而一旦染上色後(hòu)們用又难以脱色這(zhè)一特点而设计的。所有的芽胞染色法都(dōu)基于同一个黃間原则：除了用著(zhe)色力强的染料外，還(h的鐵ái)需要加热，以促進(jìn)芽綠秒胞著(zhe)色。当染芽胞時(shí)，菌体也會子金(huì)著(zhe)色，然後(hòu)水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体新雜會(huì)脱色。然後(hòu)用對(du報下ì)比度强的染料對(duì)菌体复染，使菌体和芽胞朋子呈现出不同的颜色，因而能(néng)更明显地衬托出芽胞，便于观察。

（二）器材 

1.菌株：培养36小時(shí)的苏云金杆菌（Bacillus t藍風huringiensis）或者枯草杆菌（海煙Bacillus subtilis）。&nbs術美p;

2.染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.聽黑5%蕃红水溶液 3.器材：小试管（75mm×10mm）、烧杯風新（300mL）、滴管、玻片搁架、鄉舞接種(zhǒng)环、擦镜纸、镊子、显微镜等。

（三）方法 

1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法 

（1）制备菌液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接種(zhǒng)环高冷从斜面(miàn)上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成(ché開她ng)浓稠的菌液。 

（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用章遠接種(zhǒng)环搅拌使染料与菌液充小車分混合。 

（3）加热：將(jiāng)此试長視管浸于沸水浴（烧杯），加热15—20min。&n訊資bsp;

（4）涂片：用接種(zhǒng)环从试管化刀底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成(chén街信g)涂面(miàn)，晾干。&n是舞bsp;

（5）固定：將(jiāng)涂片通說的過(guò)酒精灯火焰3次。 

（6）脱色：用水洗直至流出的水靜城中无孔雀绿颜色为止。 

（7）复染：加蕃红水溶液染色5m路暗in後(hòu)，倾去染色液，不用水洗，直接用吸音影水纸吸干。 

（8）镜检：先低倍，再高倍，最後(hòu)用油镜观察。 结果：志有芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。

2.Schaeffer与Fulton氏染色法 

（1）涂片：按常规方法將(jiāng)待检细菌制成(chéng)一薄的涂妹煙片。 

（2）晾干固定：待涂片晾干後(hòu)在酒精灯火焰上通過月計(guò)2—3次。

（3）染色：

①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片喝些处（染料以铺满涂片为度），然後(hòu)將(jiāng)涂片放在铜板上他長，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽時(shí)開(kāi)始计算時(shí)间長大，约维持15-20min。加热過請人(guò)程中要随時(shí)添加染色液，切勿让标本干涸。（加热時(sh用內í)温度不能(néng)太高）。

②水洗：待玻片冷却後(hòu) ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色了個液为止。 ③复染：用蕃红液染色5min。 （4）水洗、晾干或吸干。 （愛醫5）镜检：先低倍，再高倍，最後(hòu)在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。 结視身果：芽胞呈绿色，菌体为红色。

（四）注意事(shì)项

1.供芽胞染色用的菌種(zhǒng)应秒司控制菌龄。 

2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面(miàn)都(dōu)较能麗常规涂片法优越，可优先使用。 

3.用改良法時(shí)，欲得到(dào)好(hǎo)的涂片，首先要制分嗎备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液時(shí)，应先用接種(z知金hǒng)环充分搅拌，然後(hòu)再挑取菌液，否则菌体沉醫制于管底，涂片時(shí)菌体太少。

细菌的荚膜染色法

（一）原理

由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易著(zhe)色，通計弟常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景著(zhe)色而荚膜不著拿但(zhe)色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量筆愛在90%以上，故染色時(shí)一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。

（二）器材

1.菌株：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillu身南s mucilaginosus，俗称“钾细菌"）。该菌在甘露醇作路樂碳源的培养基上生長(cháng)時(能車shí)，荚膜丰厚。 

2.染色液和试剂 ：Tyler法染色液見計、用滤纸過(guò)滤後(hòu)的绘图墨水關黑、复红染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、如愛1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。

3.器材： 载玻片、玻片搁架， 擦镜纸、显微镜等。

（三）方法 

推荐以下四種(zhǒng)染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各種(z雪腦hǒng)有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。

1.负染色法： 

（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少著兒量菌体放入水滴中混匀并涂布。 

（2）干燥：將(jiāng)涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 做兵;

（3）染色：在涂面(miàn)上加复红染色液染色2亮吃—3min。 

（4）水洗：用水洗去复红染液。

（5）干燥：將(jiāng)染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。&nbs又明p;

（6）涂黑素：在染色涂面(miàn)左边自些加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使很學黑素沿玻片边缘散開(kāi)，然後(hòu)向(xi理愛àng)右一拖，使黑素在染色涂面(miàn)上成(chéng)为一薄层，并這們迅速风干。 

（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。 结果：背務答影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。

2.湿墨水法 

（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌用會体与其充分混合均匀。 

（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然後(hòu)在盖玻花線片上放一张滤纸，向(xiàng)下轻压，吸去多行務余的菌液。 

（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。 作技

结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明下唱圈即为荚膜。

3.干墨水法 

（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载會地玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加資從1环墨水，充分混匀。 

（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，將(jiāng)载玻片理爸的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散開(黃醫kāi)，然後(hòu)以30度角，迅速而均匀地將(jiā信技ng)菌液拉向(xiàng)玻片的一端，使菌液铺自車成(chéng)一薄膜。 

（3）干燥：空气中自然干燥。 

（4）固定：用甲醇浸沒(méi)涂片，森愛固定1 min，立即倾去甲醇。 鄉綠;

（5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。 月習;

（6）染色：用甲基紫染1—2min。 

（7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。 

（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体紫色，荚子慢膜呈一清晰透明圈。

4.Tyler法 

（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分理風混合，并將(jiāng)粘稠的菌液尽量涂開(kāi)，但涂布書船的面(miàn)积不宜過(guò)大。 

（2）干燥：在空气中自然干燥。

（3）染色：用Tyler染色液染5—7min。 

（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）做制。用吸水纸吸干，并立即加1—2滴香柏油于做影涂片处，以防止CuSO4结晶的形成(chéng)。 

（5）镜检：先用低倍镜再用高倍討得镜观察。观察完毕後(hòu)注意用放什二甲苯擦去镜头上的香柏油。 结果：背景蓝嗎南紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。

（四）注意事(shì)项

1.加盖玻片時(shí)不可有气泡，否则會(huì)影响观察。

2.应用干墨水法時(shí)，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥費訊，不可使玻片發(fā)热。 就書;

3.在采用Tyler法染色時(shí)，标本經(jīng)染色後(h件林òu)不可用水洗，必须用20%C章黃uSO4冲洗