军团菌检测方法

   军团菌是一種(森長zhǒng)环境感染性致病菌，可引起人開(qǐ)急性呼吸道(dào)传染病，即军团菌病。军团菌分布极睡妹其广泛，医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各種姐山(zhǒng)水源均易于滋生、污染军团菌，并造成(chéng)军团菌病传染志坐的风险。即与水有关的地方均可能(néng藍事)存在军团菌。

　　军团菌传播、感染有以下特点：

1、透過(guò)空气、水份感染，传播带季节性，超過(g火化uò)50%病例在夏季發(fā)生。

2、滋生在医院、酒店的供水系统，通過(guò)過你生(guò)水、浴室传播。

3、可通過(guò)空调的冷却系统，由通风口传播并感染對(duì)鐘自象。

　　军团菌属革兰氏阴性杆菌，专性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌需月子要半胱氨酸和铁，无半胱氨酸時(shí)，军团菌无法生長(c冷算háng)。生化特征還(hái)有不發(fā)酵也不氧化糖类，不還(hái)原習關硝酸盐，氧化酶实验阴性或弱阳性，尿素酶線計阴性，军团菌生長(cháng)的zui适pH为6.9-7吧歌.0，2%-5%CO2能(néng)促進(jìn)部分菌株的生長(chá都新ng)。军团菌生長(cháng)缓慢，易于被(b村身èi)其它菌落覆盖。军团菌的菌落颜色多樣(yàn村綠g)，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能(néng)显深褐色、灰慢和绿色、深红色。菌落整齐，表面(miàn)光滑，在紫外灯下，有荧光。目前军团菌文書分为64種(zhǒng)血清型及42个種(zhǒng)。

 二、军团菌的检测方法---ISO11731:1998&n還飛bsp;

1.范围

 本标准描述了一種(zhǒng)用于军吃都团菌分离和估计环境樣(yàng)品中军团菌数量呢鐘的培养方法。该方法适用于所有环境樣(yàng)本，包括饮用水、工业用水和天然水森家以及沉淀物、沉积物和粘土/软泥等相关樣(yàng)本。

2.培养基和试剂

2.1：CP0020 BCYE平我微板（军团菌生長(cháng)平板）    &n道知bsp;    &子兵nbsp;   &n可花bsp;   們物;

2.2：P0030 BCYE-CYS平板（BCY媽又E无L-半胱氨酸平板）     &n美裡bsp;

2.3：CP0040 GVPC选择性平板（军团菌选择性書玩平板）       

2.4：酸处理缓冲液

3．取樣(yàng)

3.1取樣(yàng)容器

水樣(yàng)可采用玻璃、聚乙烯或类似容器。以前用過姐路(guò)的容器应该清洗干净、扣干水分，121℃高压灭菌樂化15min。如果容器不能(néng)經(jīng兵區)受高压灭菌，应在高于70℃的流动热水或流动蒸汽中处理至少5min光歌。

3.2含生物防腐剂的樣(yàng)品

如果水樣(yàng)中含有或被(bèi)认为含有氧化型生物防腐剂化自，应在取樣(yàng)時(sh嗎麗í)或取樣(yàng)前加入非活性试剂加以中和。如果水樣(yàng)河老中含有消毒剂，需在采樣(yàng)前或采樣(yàn務拿g)後(hòu)加入中和剂，含氯或氧化型海舞消毒剂可用流代流酸钠或硫代硫酸钾作中和剂。原则上讲，实看店验室接到(dào)水樣(yàng)後(hòu)应尽快進(jìn)行微生物學黑和(xué)分析，是取樣(yàng)当天，尤其玩地對(duì)于已知含生物防腐剂的樣(yàng)品。因此，建议从樣(yàng)商訊品采集到(dào)制备好(hǎo)浓缩樣(yàng)的友短间隔为2d，不应超過(guò)5d，zui長弟月(cháng)不超過(guò)14d。輛子

 3.3樣(yàng)品运输

樣(yàng)品应在6-18℃条件下被(bèi)运输，应避免热和光照，在1d司個内，不超過(guò)2d將(jiāng)樣(yàng)品送到(dào)实验室。還這

4．制樣(yàng)

4.1 总则

如果液体樣(yàng)品军团菌的数腦科量估计超過(guò)105CFU/L，可以采用直接平板法，即直接涂但用布于GVPC平板。为了确保低于這(zhè)个数量樣(yàng)品中军团菌的道黑检测，需采用浓缩技术。为了浓缩水樣(yàng)，可商票采用膜過(guò)滤法（4.2）或离月要心法（4.3）。

4.2膜過(guò)滤法

如果樣(yàng)品是浑浊的、乳浊的或有颜色的，应采用离心法海有。采用MFS型膜過(guò)滤装置進(jìn)笑習行膜過(guò)滤，采用直径47mm，孔径0.22μm和0.件綠45μm的无菌白底黑格膜。過(guò)滤後(hòu)的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，為音加5ml-25ml的无菌稀释液或无菌去离子水，不断摇动至少東大2min。也可將(jiāng)容器放入超声波中2-10m還相in。

4.3.离心法

取200ml樣(yàng)品于300-500ml容积的离心瓶中，6學裡000g离心10min或3000g离心30min，保持温度在15-2弟雪5℃，弃去上清液，將(jiāng)沉淀物悬浮在2間議-20ml无菌稀释液或无菌去离子水中。

培养

5.1.將(jiāng)制备好(hǎo)的樣(yàng)品請木（浓缩的或未浓缩的）分成(chéng)3份，朋事1份不做任何处理；1份進(jìn)行热处理；1份進(jìn)行酸处理爸票。

5.2热处理：加1±0.5ml樣(yàn我店g)品于一无菌容器中，50±1℃水浴处理3區資0±2min。

5.3.酸处理:加1-10ml樣(yàng)品于一拧盖的容器中，6000g离心懂哥10min或3000g离心30min，用无菌枪头河章吸去一半体积的上清液，通過(guò)涡旋重新悬浮剩余物用酸处理缓冲液补足廠員原始体积。混合静置5±0.5min。

5.4.革兰氏染色:团菌生長(cháng)较慢，次日生長(ch從通áng)的菌落可直接弃去。军团菌相時菌落颜色多樣(yàng)，通常呈白色、灰色、制文蓝色或紫色，也能(néng)显深褐色、灰近從绿色、深红色。菌落整齐，表面(miàn)光滑，在紫外灯用話下有荧光。军团菌为革兰氏阴性杆菌。

5.4.菌落验证:从每个平皿上选几个可疑菌落，接種(z森都hǒng)BCYE、BCYE-Cys平板和血平板進街報(jìn)行传代培养，凡在BCY村了E平板上生長(cháng)，而在BCY習刀E-Cys平板上不生長(chán光喝g)的菌极可能(néng)是军团菌。

5.5.军团菌计数：从三个GVPC平板中选择确证菌数zui會暗多的平板進(jìn)行计数，再除以浓缩倍数，作为军团菌数的估计值。